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    如何選擇流式細(xì)胞術(shù)常用的熒光素?

    發(fā)布時(shí)間: 2021-12-01  點(diǎn)擊次數(shù): 1829次

    流式細(xì)胞儀測(cè)定常用的熒光染料有很多種,我們?nèi)绾蝸?lái)選擇流式細(xì)胞儀測(cè)定的常用熒光染料呢?以下簡(jiǎn)單介紹了熒光素選擇的幾個(gè)原則。





    1. 抗原的密度

    ① 高表達(dá)的抗原可選擇幾乎所有的熒光素;

    ② 低密度表達(dá)的抗原需要可提供較高S/N比值的熒光素如PE/APC。


    2. 自發(fā)熒光

    ① 每種細(xì)胞群都有不同水平的自發(fā)熒光;

    ② 所有的熒光通道均可觀察到自發(fā)熒光,但自發(fā)熒光強(qiáng)度在波長(zhǎng)較長(zhǎng)時(shí)迅速降低;

    ③ 對(duì)自發(fā)熒光較強(qiáng)的細(xì)胞,選擇發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光素(如APC)可得到較好的S/N比值;

    ④ 對(duì)自發(fā)熒光比較弱的細(xì)胞,發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光素對(duì)S/N提高沒(méi)有明顯的改善。可選用FITC。


    3. 非特異結(jié)合

    ① 許多熒光抗體可產(chǎn)生低水平的非特異結(jié)合,使陰性細(xì)胞群的熒光超出自發(fā)熒光;

    ② 非特異結(jié)合由下列因素引起:

    單克隆抗體的同型抗體:一些IgG同型抗體可能與一些細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合;

    所用的熒光素:羰花青染料(如CY3、CY5、CY5.5、CY7)和Tex-Red直標(biāo)的抗體及一些復(fù)合染料標(biāo)記的抗體在標(biāo)記某些亞群的細(xì)胞時(shí)有時(shí)會(huì)提高結(jié)合率;對(duì)CY5來(lái)說(shuō),是因?yàn)樵撊玖吓c低親和力Fc受體的極低親和力相互作用。這也是復(fù)合染料PE-CY5的特性。


    4. 復(fù)合染料:小心信號(hào)衰退

    ① 復(fù)合染料因?yàn)楣?、固定劑或溫度升高?huì)致信號(hào)衰退,是復(fù)合染料在上一級(jí)染料處發(fā)光。該種現(xiàn)象從一小部分亞群開(kāi)始,導(dǎo)致APC或PE染色細(xì)胞群假陽(yáng)性;

    ② 減少樣本暴露于光、高溫或固定劑,可很大程度上避免這一問(wèn)題;

    ③ 選擇染料時(shí)需要考慮:復(fù)合染料的信號(hào)衰退會(huì)不會(huì)降低APC或PE的靈敏度。如果是,就要選擇另外的試劑搭配;

    ④ 如果樣本需要固定,要選擇穩(wěn)定的固定劑,可有效阻止復(fù)合染料的信號(hào)衰退。


    5. 熒光信號(hào)之間的干擾,會(huì)增加信號(hào)檢測(cè)背景

    ① 熒光信號(hào)強(qiáng)細(xì)胞群體的SD比熒光信號(hào)弱的細(xì)胞群體大;

    ② 多色分析時(shí),一種熒光素(如FITC)的光會(huì)漏入相鄰的熒光素(如PE)的檢測(cè)器。漏入的光越多,需要補(bǔ)償?shù)脑蕉?,?duì)分辨率的影響就越大。尤其是弱表達(dá)的信號(hào)。


    6. 盡量減少熒光信號(hào)之間的干擾

    ① 檢測(cè)的顏色越多,面臨的熒光信號(hào)之間的干擾越多;

    ② 選擇試劑組合時(shí)盡可能降低熒光發(fā)射波長(zhǎng)之間的重疊。


    7. 儀器配置的差異,多色分析不可能全選“最亮"的熒光素,但對(duì)于特定的一款儀器,可以根據(jù)熒光的強(qiáng)弱列出可選的染料。


    8. 亮度的判斷:就是熒光染料的靈敏度,區(qū)分背景和弱陽(yáng)性信號(hào)的能力。


    9. 影響背景的因素有檢測(cè)器的電子噪音、細(xì)胞自發(fā)熒光、來(lái)自其他檢測(cè)器的信號(hào)干擾,這些因素也增加了陰性熒光峰的寬度(標(biāo)準(zhǔn)差)。


    10.靈敏度好的標(biāo)準(zhǔn)是染色指數(shù):D/W,D指的是陽(yáng)性峰與陰性峰的平均熒光強(qiáng)度的差;W是陰性峰的2SD。




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